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流动相的pH和缓冲液离子浓度对分离和色谱保留的影响

发布日期:2014-07-08 点击:3501
  用反相色谱分离酸性或碱性组分要求流动相为酸性或碱性,或者加入缓冲液。酸、碱和缓冲液的概念是一致的,但在HPLC的流动相中加酸、加碱的作用和加缓冲液的作用有些不同。
  反相色谱的固定相是以烷烃链为主的非极性键合相,加十八烷基硅烷(C18),对非极性组分保留时间长,对极性组分保留时间短。
  流动相的pH<7时,酸性分为游离型(RCOOH),极性小,碱性组分为离子型(RNH3.C1),极性大。酸性组分在色谱柱上保留时间长,能充分在固定相和流动相之间多次分配,使用权得组分彼此间得以分离,增加组分的选择性。
  若流相的pH>7时,碱性组分为游离型(RNH2),极性小,酸性组分为离子型(RCOO-Na),极性大。有利于碱性组分的分离。
  所以在分离酸性组分时流动相的pH<7,在分离碱性组分流动相的pH≥7。
  分析带有竣基(—COOH)的次甘草酸,用的是典型的反相HPLC,随着流动相的pH值减小,保留不断加大。
  单纯用酸或碱调节流动相的pH值是比较极端的情况,除非混合样品中的组分是清一色的酸性组分或是清一色的碱性组分,一般不单加酸或单加碱。通常要分离的组分性质是多种多样的,必须采用缓和的、经得直冲击的缓冲液流动相。
  HPLC常用的缓冲液是由下列三类缓冲物质对配制的:乙酸、乙酸钠(pH=3~6);磷酸-磷酸盐(K+,Na+)pH=2~8);三羟甲基氨甲烷(Tris)-GC1(pH=7~9)。
  磷酸-磷酸盐系列是硬酸盐,与有机溶剂(甲醇、乙腈)混合时容易析了出不易看到的细微晶体。过滤掉,流动相的组成改变。不过滤,晶体伤泵、伤进样器、伤柱、伤检测器。如能满足实验条件,先选用软酸盐(乙酸盐、Tris系列)。
  用缓冲液千万不要忘记冲洗干净。
  一些离子型的组分在无缓冲液的流动相中会离解生成H+或OH-,组分在柱内形成谱带的那一部分引起流动相pH的变化,对色谱的分离产生影响。流动相内加了缓冲液使pH值的在一个范围内还会变化,而且应变力是强大的,小小的组分离解引pH值的变化,而且应变力是强大的,小小的组分离解引起pH值的变化不足以改变整个流动的pH值。
  例如分析一组酸性组分的样品:萘磺酸、肾上腺素、苯甲醇、去甲变肾上腺素。这些组分有的酸性强,有的酸性弱,有的呈两性。还是采用C18柱,磷酸盐冲液-甲醇为流动相,如果缓冲物质对的浓度过低,4个组分间的分离差,色谱峰严惩扬长拖尾。提高缓冲液的冲物质对浓度上述缺点得到克服。

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